Ako sa ORF a adaptéry používajú pri vytváraní knižníc založených na CRISPR?

Technológia CRISPR (zhlukovaná pravidelne prepletená krátkymi palindromickými opakovaniami) revolúcia v oblasti genetického inžinierstva, ktorá ponúka silný nástroj na úpravu genómu, reguláciu génov a štúdie funkčnej genomiky. Konštrukcia knižníc založených na CRISPR je rozhodujúcim krokom vo veľkých genetických obrazovkách, čo vedcom umožňuje systematicky skúmať génovú funkciu v celom genóme. V tomto blogu preskúmame, ako sa pri vytváraní knižníc založených na CRISPR používajú otvorené čítanie (ORF) a adaptéry, a tiež predstavia naše ponuky ako dodávateľ ORF a adaptérov.

Pochopenie ORF v CRISPR - konštrukcia knižnice založenej na CRISPR

Otvorené čítacie rámce (ORF) sú časti génovej sekvencie DNA, ktorá sa môže preložiť na proteíny. V kontexte konštrukcie knižnice CRISPR zohrávajú ORF dôležitú úlohu v obrazovkách zisku - funkcie (GOF). Cieľom týchto obrazoviek je identifikovať gény, ktoré po nadmernom exprimovaní poskytujú konkrétny fenotyp, ako je zvýšená proliferácia buniek, rezistencia na liečivo alebo zmenená morfológia buniek.

Na zostavenie knižnice GOF založenej na CRISPR sa ORF najskôr izolujú z knižnice cDNA alebo syntetizované de novo. ORF sa potom klonujú do vhodného vektora, často lentivírusového alebo retrovírusového vektora, ktorý môže účinne dodávať genetický materiál do cieľových buniek. Vektor obsahuje regulačné prvky, ako je promótor, na riadenie expresie vloženého ORF.

Proces klonovania ORF do vektora zvyčajne zahŕňa štiepenie a ligáciu reštrikčných enzýmov. ORF sa trávi špecifickými reštrikčnými enzýmami, ktoré vytvárajú kompatibilné konce s digested vektorom. Dva fragmenty DNA sa potom ligujú spolu pomocou DNA ligázy, čím sa vytvárajú rekombinantný plazmid. Tento plazmid sa môže ďalej amplifikovať v baktériách a potom zabalený do vírusových častíc na dodávanie do buniek.

Po zavedení vektorov obsahujúcich ORF do buniek sa ORF prepisujú a prekladajú na proteíny. Skríningom veľkého počtu buniek exprimujúcich rôzne ORF môžu vedci identifikovať gény, ktoré sú spojené s požadovaným fenotypom. Tento prístup sa používa na objavenie nových hnacích silov rakoviny, génov zapojených do imunitných reakcií a regulátorov diferenciácie kmeňových buniek.

Úloha adaptérov v konštrukcii knižnice CRISPR

Adaptéry sú krátke sekvencie DNA, ktoré sa používajú na modifikáciu fragmentov DNA počas konštrukcie knižnice. V kontexte knižníc založených na CRISPR slúžia adaptéry niekoľko dôležitých funkcií.

1. Linkerové adaptéry na klonovanie

Pri klonovaní ORF alebo iných fragmentoch DNA do vektora sa môžu adaptéry linker použiť na vytvorenie kompatibilných koncov medzi vložkou a vektorom. Napríklad, ak majú ORF a vektor rôzne miesta reštrikčných enzýmov, adaptéry linkerov môžu byť navrhnuté tak, aby mali jeden koniec kompatibilný s ORF a druhý koncový kompatibilný s vektorom. To umožňuje účinnú ligáciu vložky do vektora, aj keď prírodné konce nie sú priamo kompatibilné.

2. Adaptéry čiarových kódov na multiplexovanie

Na obrazovkách CRISPR vo veľkom meradle je často potrebné multiplexovať viac vzoriek alebo knižníc. Adaptéry čiarových kódov sa používajú na označenie každého jednotlivého fragmentu DNA alebo knižnice s jedinečnou sekvenciou čiarových kódov. Tieto čiarové kódy umožňujú identifikáciu a sledovanie každej vzorky počas sekvenovania a analýzy údajov. Napríklad v zhromaždenej obrazovke CRISPR sa rôzne populácie buniek alebo experimentálne podmienky môžu označiť rôznymi čiarovými kódmi. Po sekvenovaní sa môžu informácie čiarového kódu použiť na určenie, ktoré čítania patria do ktorej vzorky, čo umožňuje porovnanie rôznych podmienok v jednom sekvencovom behu.

3. Adaptéry amplifikácie pre PCR

Amplifikácia PCR je spoločným krokom v konštrukcii knižnice na zvýšenie množstva DNA. Amplifikačné adaptéry sú navrhnuté tak, aby žíhali na konce fragmentov DNA a slúžili ako priméry pre PCR. Tieto adaptéry môžu tiež obsahovať ďalšie prvky, ako sú napríklad sekvenčné väzbové miesta primérov alebo jedinečné molekulárne identifikátory (UMI). UMI sú náhodné sekvencie, ktoré sa pridávajú do každej molekuly DNA počas prípravy knižnice. Môžu byť použité na korekciu pre predpätie amplifikácie PCR a chyby sekvenovania, zlepšenie presnosti kvantifikácie a analýzy.

Naše ponuky ako dodávateľ ORF a adaptéry

Ako popredný dodávateľ ORF a adaptérov ponúkame širokú škálu výrobkov na podporu konštrukcie knižnice založenej na CRISPR. Naše ORF sú starostlivo kurátorské a overené, aby sa zabezpečila vysoká - kvalita a sekvencie úplnej dĺžky. Ponúkame ORF z rôznych druhov, vrátane človeka, myši a potkana, a tiež môžeme poskytnúť vlastné syntetizované ORF na základe konkrétnych požiadaviek zákazníkov.

Naše adaptéry sú navrhnuté s presnosťou a sú k dispozícii v rôznych formátoch, aby vyhovovali rôznym potrebám konštrukcie knižnice. Či už potrebujete adaptéry linkerov na klonovanie, adaptéry čiarových kódov na multiplexovanie alebo amplifikačné adaptéry pre PCR, máme pre vás správne riešenie.

Poskytujeme tiež vysoko kvalitné ORF a adaptéry so spoľahlivým výkonom. Napríklad nášOrFS Union Lett 90 ° Hydraulický adaptérje navrhnutý tak, aby poskytoval bezpečné a bezplatné spojenie v hydraulických systémoch, ktoré je tiež metaforou stabilného a spoľahlivého spojenia v genetických konštruktoch. Náš90 ° nastaviteľný hydraulický adaptér lakťa v laktePonúka flexibilitu v inštalácii, podobná flexibilite, ktorú poskytujeme pri prispôsobovaní našich výrobkov tak, aby vyhovovali rôznym experimentálnym nastaveniam. A nášORFS SWIVEL RUN TREE HYDRAULICKÉ KARRY A ADAPTIRYsú známe svojou hladkou prevádzkou, rovnako ako naše ORF a adaptéry zaisťujú hladké a efektívne procesy výstavby knižníc.

Kontaktujte nás kvôli obstarávaniu a spolupráci

Ak vás zaujímajú naše ORF a adaptéry pre vaše projekty výstavby knižníc CRISPR, vyzývame vás, aby ste nás kontaktovali kvôli obstarávaniu a spolupráci. Náš tím expertov je pripravený vám pomôcť pri výbere správnych produktov pre vaše konkrétne potreby a poskytovanie technickej podpory počas vášho výskumného procesu. Či už ste malý akademický laboratórium alebo veľká farmaceutická spoločnosť, sme odhodlaní pomáhať vám dosiahnuť vaše výskumné ciele s vysoko kvalitnými výrobkami a vynikajúcimi službami.

Odkazy

1. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N.,… & Zhang, F. (2013). Multiplexné genómové inžinierstvo pomocou systémov CRISPR/CAS. Science, 339 (6121), 819 - 823.
2. Shalem, O., Sanjana, NE a Zhang, F. (2014). Vysoko - výkonná funkčná genomika s použitím CRISPR - CAS9. Nature Reviews Genetics, 15 (8), 591 - 603.
3. Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM a Lander, ES (2014). Genetické obrazovky v ľudských bunkách pomocou systému Crispr - Cas9. Science, 343 (6166), 80 - 84.