Ako ovplyvňujú ORF a adaptéry pokrytie sekvenačných čítaní?

V oblasti genomiky zaznamenali technológie sekvenovania za posledných niekoľko desaťročí pozoruhodný pokrok. Jedným z kritických aspektov v sekvenčných projektoch je pokrytie sekvenčných čítaní, ktoré sa týka počtu, koľkokrát je konkrétny nukleotid v genóme sekvenovaný. Pokrytie je ovplyvnené množstvom faktorov a v tomto blogu preskúmame, ako otvorené čítacie rámce (ORF) a adaptéry zohrávajú významnú úlohu pri určovaní pokrytia sekvenčných čítaní. Ako popredný dodávateľ ORF a adaptérov sa dobre orientujeme v zložitosti týchto komponentov a ich vplyve na výsledky sekvenovania.

Pochopenie otvorených rámcov na čítanie (ORF)

Otvorené čítacie rámce sú segmenty DNA alebo RNA, ktoré môžu byť potenciálne preložené do proteínov. Začínajú štartovacím kodónom (zvyčajne ATG v DNA) a končia stop kodónom (TAA, TAG alebo TGA v DNA). ORF sú v genomike veľmi zaujímavé, pretože často predstavujú kódujúce oblasti génov.

Dĺžka a pokrytie ORF

Dĺžka ORF môže mať podstatný vplyv na pokrytie sekvenčných čítaní. Dlhšie ORF vo všeobecnosti vyžadujú viac sekvenčných čítaní, aby sa dosiahlo dostatočné pokrytie. Je to preto, že pravdepodobnosť pristátia sekvenčného čítania v rámci dlhého ORF je nižšia v porovnaní s krátkym. Napríklad, ak máme dva ORF, jeden dlhý 100 párov báz a ďalší 1000 párov báz, a máme pevný počet sekvenčných čítaní, je pravdepodobnejšie, že kratší ORF bude úplne pokrytý. V sekvenčnom experimente, ak je cieľom získať vysokokvalitné údaje pre všetky ORF v genóme, môže byť potrebné špecifickejšie zamerať dlhšie ORF, aby sa zabezpečilo primerané pokrytie.

Zložitosť a pokrytie ORF

Zložitosť ORF, ktorá zahŕňa faktory, ako je zloženie nukleotidov a sekundárna štruktúra, môže tiež ovplyvniť pokrytie sekvenovaním. Napríklad ORF s vysokým obsahom GC je často ťažšie sekvenovať. Polymerázy používané v sekvenčných reakciách môžu mať problémy s čítaním cez oblasti s vysokým obsahom GC, čo vedie k nerovnomernému pokrytiu. Niektoré oblasti môžu byť nedostatočne sekvenované, zatiaľ čo iné môžu byť nadmerne sekvenované v dôsledku zastavenia polymerázy. Sekundárne štruktúry v rámci ORF, ako sú vlásenky, môžu tiež interferovať s procesom sekvenovania, čo vedie k medzerám v pokrytí.

Úloha adaptérov v sekvenčnom čítaní pokrytia

Adaptéry sú krátke sekvencie DNA, ktoré sú pripojené na konce fragmentov DNA pred sekvenovaním. Slúžia niekoľkým dôležitým funkciám v pracovnom postupe sekvenovania a ich dizajn a kvalita môžu výrazne ovplyvniť pokrytie čítania sekvenovaním.

Účinnosť ligácie adaptéra

Účinnosť ligácie adaptéra je rozhodujúca pre dosiahnutie rovnomerného pokrytia. Ak adaptéry nie sú správne naviazané na fragmenty DNA, niektoré fragmenty nemusia byť sekvenované vôbec. To môže viesť k medzerám v pokrytí genómu. Napríklad v kroku prípravy knižnice, ak ligačná reakcia nie je optimalizovaná, značný počet fragmentov DNA môže zostať neligovaných a tieto fragmenty nebudú zahrnuté do sekvenovania. Ako dodávateľ vysokokvalitných adaptérov zaisťujeme, že naše produkty majú vysokú účinnosť ligácie, čo pomáha minimalizovať takéto medzery v pokrytí.

Predpätie adaptéra

Skreslenie adaptéra môže tiež ovplyvniť pokrytie sekvenčného čítania. Niektoré adaptéry môžu preferovať ligáciu na určité typy fragmentov DNA. Napríklad môžu mať vyššiu afinitu k fragmentom so špecifickými nukleotidovými sekvenciami alebo dĺžkami. To môže mať za následok nadmerné zastúpenie niektorých fragmentov v sekvenačnej knižnici a nedostatočné zastúpenie iných, čo vedie k nerovnomernému pokrytiu v rámci genómu. Naša spoločnosť vyvinula pokročilé návrhy adaptérov, ktoré minimalizujú skreslenie adaptéra a zabezpečujú rovnomernejšie pokrytie sekvenčných čítaní.

Adaptér - Ligácia adaptéra

Ďalším problémom, ktorý môže ovplyvniť pokrytie, je adaptér - ligácia adaptéra. Ak sa dva adaptéry navzájom ligujú bez vloženého fragmentu DNA medzi nimi, môžu vytvárať diméry. Tieto diméry môžu byť v niektorých prípadoch prednostne sekvenované, čím sa znižuje počet dostupných sekvenčných čítaní pre aktuálne požadované fragmenty DNA. Naše produkty adaptérov sú navrhnuté tak, aby minimalizovali ligáciu adaptér - adaptér, čím sa zvyšuje podiel sekvenčných čítaní, ktoré sa mapujú na cieľovú DNA.

Vplyv ORF a adaptérov na rôzne technológie sekvenovania

Sekvenovanie ďalšej generácie (NGS)

V technológiách NGS, ako je sekvenovanie Illumina, je kombinácia charakteristík ORF a výkonu adaptéra rozhodujúca pre dosiahnutie vysoko kvalitných výsledkov. Krátke dĺžky čítania v sekvenovaní Illumina znamenajú, že dlhšie ORF môžu vyžadovať viac čítaní, aby boli úplne pokryté. Okrem toho môže vysoko výkonná povaha NGS zhoršiť problémy súvisiace s adaptérom, ako je skreslenie a tvorba dimérov. Naše ORF a adaptéry sú optimalizované pre aplikácie NGS a poskytujú spoľahlivé výsledky s konzistentným pokrytím.

Sekvenovanie tretej generácie

Sekvenčné technológie tretej generácie, ako je sekvenovanie PacBio a Nanopore, majú v porovnaní s NGS dlhšiu dĺžku čítania. To môže byť výhodou pri sekvenovaní dlhých ORF, pretože to znižuje potrebu veľkého počtu čítaní na pokrytie celého ORF. Tieto technológie však majú aj svoje vlastné výzvy, napríklad vyššiu chybovosť. Naše produkty sú navrhnuté tak, aby fungovali v spojení s týmito technológiami, čím pomáhajú zlepšiť celkové pokrytie a kvalitu sekvenčných údajov.

Naše produkty: Zabezpečenie optimálneho pokrytia

Ako dodávateľ ORF a adaptérov sme odhodlaní poskytovať produkty, ktoré zlepšujú pokrytie sekvenčného čítania. Naše ORF sú starostlivo navrhnuté a syntetizované tak, aby bola zabezpečená vysoká kvalita a reprezentatívnosť. Ponúkame širokú škálu ORF s rôznymi dĺžkami a sekvenciami, aby sme uspokojili rôznorodé potreby našich zákazníkov.

Naše adaptéry sú tiež najvyššej kvality. Sú navrhnuté tak, aby mali vysokú účinnosť ligácie, nízku odchýlku a minimálnu tvorbu dimérov. Uskutočnili sme rozsiahly výskum a vývoj, aby sme optimalizovali výkon našich adaptérov v rôznych technológiách sekvenovania.

Ponúkame rôzne typy adaptérov, vrátaneKonektor pre prepážku ORFS 90°,90 Šesťhranné samce NPTF hydraulické adaptéry, aHydraulické armatúry NPT. Tieto adaptéry sú vhodné pre rôzne sekvenčné aplikácie a môžu vám pomôcť dosiahnuť rovnomernejšie a spoľahlivejšie pokrytie sekvenčného čítania.

Záver

Záverom možno povedať, že ORF aj adaptéry hrajú zásadnú úlohu pri určovaní pokrytia sekvenčných čítaní. Dĺžka, zložitosť ORF a účinnosť, skreslenie a tvorba dimérov adaptérov prispievajú k celkovej kvalite sekvenčných údajov. Ako dodávateľ rozumieme týmto faktorom a vyvinuli sme vysokokvalitné produkty na riešenie problémov spojených s pokrytím sekvenčného čítania.

Ak sa podieľate na výskume genomiky a hľadáte spoľahlivé ORF a adaptéry na zlepšenie výsledkov sekvenovania, pozývame vás, aby ste nás kontaktovali kvôli obstarávaniu a ďalším diskusiám. Náš tím odborníkov je pripravený pomôcť vám nájsť najlepšie riešenia pre vaše špecifické potreby.

Referencie

1. Metzker, ML (2010). Sekvenčné technológie - ďalšia generácia. Nature Reviews Genetics, 11(1), 31 - 46.
2. Quail, MA, Smith, M., Coupland, P., Otto, TD, Harris, SR, Connor, TR, … & Parkhill, J. (2012). Príbeh troch sekvenčných platforiem novej generácie: porovnanie sekvenátorov Ion Torrent, Pacific Biosciences a Illumina MiSeq. BMC genomika, 13(1), 341.
3. Van Dijk, EL, Auger, H., Jaszczyszyn, Y., & Thermes, C. (2014). Desať rokov technológie sekvenovania novej generácie. Trendy v genetike, 30(9), 418 - 426.